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优化ELISA的技巧

更新时间:2025-02-10      浏览次数:18

1. 选择合适的ELISA格式

由于ELISA的设计非常灵活,因此可以根据实验需求进行合适的格式选择。最好使用简单的ELISA格式,这样对成本控制更有利;但是同样的,还需要考虑特异性、干扰等问题。例如,如果是筛选合适的单抗,那么简单的直接或间接ELISA比较合适;如果是在复杂基质中特异性检测目标待测物时,则夹心ELISA是好的选择。如果是检测一些分子量较小,同时关键试剂不好获得时,竞争ELISA则是更好的选择。


2. 选择合适的包被表面(板)
由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的平底96孔板用于绝大多数ELISA分析。使用专为ELISA设计的板非常重要,因为它们的制造是为了保持一致性、最大限度地减少边缘效应并为数据收集提供最佳光学条件。最好选择值得信赖的厂家,或对于一些耗材提供商的产品进行产品性能确认,通过对同意样品标准化操作,然后比较批内和批间各个孔的信号差异,尽量控制到5%以下。
值得注意的是,一些酶法在催化底物时,产生的是荧光或者化学信号,这时候可能需要选择一些不透明的板,防止荧光透射到其它孔径中干扰检测。

除了考虑到均一性等性能外,还要考虑板的包被载量和结合特性。


关于结合特性,可能是在包被一些特殊蛋白时需考量。如:因通常ELISA包被是利用疏水作用等物理特性包被的,当需要包被的蛋白太小且大部分氨基酸都是亲水氨基酸时,常规的包被方式就不合适,这时候其实也可以更管合适的ELISA板,如处理后的亲水表面ELISA板。

3. 选择合适的包被方式

选择合适的包被方式包被主要要考虑的是包被液、温度、浓度、时间等条件。常见的包被液有碳酸盐缓冲液(CBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)。CBS pH值在9.6左右,呈弱碱性;PBS pH值在7.4左右,偏中性。包被的蛋白可能会因为一些氨基酸、等电点的原因,导致在碱性条件下包被不理想,可以尝试不同类型的包被液。

包被温度一般有4℃、室温、37℃等条件。一般包被温度和包被时间相配合。一般包被4℃和室温都是过夜包被,而37℃通常2小时左右就可以了。但是一般4℃和室温过夜包被更加稳定充分,且对蛋白保护较好,37℃可能一些蛋白不太稳定,包被均一性可能也有些不确定,在条件允许下,推荐过夜包被。包被浓度的选择一般和板载量和测量格式的适配程度相关,一般通过棋盘进行确认和选择,将会在棋盘条目进行阐述。值得注意的是,一些小蛋白如多肽很难包被,这是可选择对其进行蛋白偶联,常见的偶联物有BSA、KLH、OVA等。


4. 选择合适的封闭液

封闭液的选择关乎到ELISA的整体性能,封闭的目的是包被完成后,将空白位置填补上,防止后续步骤中的任何非目标结合的蛋白结合到板子上,造成干扰和背景信号异常。通常的封闭液都是一些无关蛋白,如BSA、动物血清、脱脂奶粉、酪蛋白等。目前也有一些针对特殊需求的非蛋白封闭剂。当你在进行ELISA检测无论如何进行试剂浓度调整,发现背景信号都很异常时,可能就是封闭液选择不对,就需要分析可能的原因。如封闭液BSA较大,在一些特殊条件下可能不能填补非特异结合的无关蛋白的结合位置,这时候就需要更换成酪蛋白等较小的封闭试剂等。

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