Western Blot 常见问题及解决方案

一、背景过高

原因：

封闭不充分；一抗过浓；孵育温度过高；一抗二抗封闭剂间有交叉反应；洗膜不充分；膜过于干燥

方案：

延长封闭时间或更换封剂；稀释一抗；4℃孵育；加入Tween-20，以减少交叉反应；设二抗对照，稀释二抗；增加洗膜次数；避免干膜

二、无条带或太弱

原因：

一抗二抗选择错误；一抗二抗浓度过低；一抗失效；蛋白含量过低；转膜不充分或洗膜过度；过度封闭；二抗受叠氛钠抑制；底物与酶失效；曝光时间过短

方案：

选择正确抗体；检查抗体和显色试剂盒保质期；提高样品蛋白含量；设内参对照，转膜对照；转膜效果的检查；减少洗膜时间

降低封闭液浓度，减少封闭时间；延长曝光时间

三、杂带过多

原因：

蛋白样本具有多种修饰；蛋白样本降解；蛋白存在二聚体或多聚体；一抗二抗浓度过高；多克隆抗体

方案：

使用去修饰的试剂；使用蛋白酶抑制剂；电泳上样前，煮沸10 min，以增强蛋白质解聚变性；降低抗体浓度；选用单克隆抗体

四、其他问题

1.背景白色条带 → 转膜时有气泡或抗体分布不均

2.暗片现白条带 → 一抗或二抗加入过多

3.目的条带过低/过高 → 胶浓度不合适

4.“微笑"条带 → 迁移过快、电泳温度过高